Op de jaarlijkse London Calling conferentie hebben CTO Clive Brown en collega's James Clarke, Stuart Reid, Lakmal Jayasinghe en Rosemary Sinclair Dokos een Oxford Nanopore tech update gegeven met een samenvatting van de status van haar nanopore sequencing platform, belangrijke recente ontwikkelingen die een verbeterde nauwkeurigheid en grotere output opleveren, en de visie voor toekomstige ontwikkelingen geschetst. Met de laatste updates kan nanopore sequencing nu zeer nauwkeurige, uitgebreide gegevens opleveren, bij hoge opbrengst, met de mogelijkheid om korte of lange fragmenten te sequencen, in real time, en alle varianttypes in één experiment, op één platform, vast te leggen. Oxford Nanopore technologie stelt gebruikers in staat de technologie af te stemmen op hun biologische vraag.

Gebruikers kunnen nu op één platform uitgebreide genomische, transcriptomische en epigenetische analyses met hoge doorvoer uitvoeren. Ook vroege gegevens over de herkenning van afzonderlijke aminozuren op het nanopore-platform werden gedeeld. Hoogtepunten van de lezing waren onder meer: De introductie van "best of both" sequencing-chemie, waarbij de nieuwste R10.4.1 flowcellen gecombineerd worden met de nieuwste Kit14 om zeer nauwkeurige sequencing-gegevens met een hoge output te leveren, waarbij 99,6% nauwkeurige single-molecule raw-read simplex-gegevens worden verkregen en 99,92% duplex met afstembare runs voor verdere flexibiliteit en optimalisatie; De huidige R9 flowcellen en Kits 10/11 - waarmee nu al een breed scala van wetenschappelijke analyses met een grote impact mogelijk is - zullen ondersteund blijven worden terwijl de gebruikers overstappen op R10.4.1 en Kit 14; Eerste zending met vroege toegang van het PromethION 2 (P2) solo-apparaat in handpalmformaat, een betaalbare nanopore-sequencer met hoge capaciteit; Ontwikkelingen in de methyleringsanalysetools, waaronder Remora, waardoor Oxford Nanopore de meest uitgebreide technologie voor het karakteriseren van methylering wordt; Voorbeelden van het nut van de Short Fragment Mode op het nanopore-platform, waaronder methylerings- en nucleosoomanalyse van celvrij DNA; Een nieuw sequencingbestandsformaat, pod5, dat fast5 moet vervangen en het schrijven van snellere bestanden mogelijk moet maken.

Dit ondersteunt de verhoging van de output en de nauwkeurigheid van het apparaat, maakt kleinere bestanden met ruwe gegevens mogelijk en stroomlijnt de downstream-analyse; De mogelijkheid om afzonderlijke aminozuren in een korte peptidesequentie te karakteriseren op het Oxford Nanopore-platform; een vroege stap in de richting van proteïne-sequencing. De overgang van Oxford Nanopore naar de R10 nanopore-reeks blijft de nauwkeurigheid verbeteren, naast de nieuwe Kit14, die dit kwartaal wordt gelanceerd. De overstap naar R10 en Kit14 combineert het beste van de vorige mogelijkheden: zeer hoge nauwkeurigheid (Kit12 bevat nieuwere enzymen maar is langzamer) en uitgangen (Kit 9/10/11 hebben hogere snelheden maar lagere nauwkeurigheid).

De eerste gegevens uit de gemeenschap wijzen op sterke prestaties met de nieuwe kit en flowcellen. Deze chemismen kunnen nu worden afgesteld door de looptemperaturen te wijzigen, die in de software programmeerbaar zullen zijn op: o 260 bps (nauwkeurigheidsmodus), 400 bps (standaardmodus) 520 bps (outputmodus): Met deze instellingen kunnen gebruikers modale simplex ruwe leesnauwkeurigheden bereiken van: 99,6% (nauwkeurigheidsmodus), 99,2% (standaardmodus) 99% (outputmodus); Alle afstembare run-instellingen leveren duplex-nauwkeurigheden rond Q30 (99,9%), waarbij de nauwkeurigheidsmodus een duplex-nauwkeurigheid van 99,92% levert. Met de nieuwste chemie is de langste duplex-lezing die perfect uitgelijnd is met een menselijke referentie 72 Kb, en de langste Q40-lezing 144 Kb.

Met de outputmodus (520 bps) hebben de teams van Oxford Nanopore 307 Gb op een enkele PromethION Flow Cell bereikt. Terwijl Oxford Nanopore doorgaat met het openstellen van DNA-sequencing voor iedereen, overal, heeft het nu een eerste-in-klasse handheld, goedkoop, ultra-high-throughput DNA-sequencing apparaat gelanceerd. De eerste PromethION 2 (P2) solo is verscheept en kan goedkope sequencing met hoge output leveren in een toestel ter grootte van een handpalm.

Proof of concept-gegevens gegenereerd op Flongle sensorchip, prototype wordt nu gebouwd: Een nieuwe generatie nanopore, met een nog langere leeskop dan de R10, belooft een verdere verbetering van de homopolyse, momenteel met een simplex-nauwkeurigheid van 98%, die sinds december met 8% is verbeterd; de ontwikkeling gaat door. Er is een nieuw raamwerk voor basecalling, Dorado, geïntroduceerd - dat uiteindelijk de toegang voor gebruikers zal versnellen. Dorado is ontworpen met ondersteuning voor Apple GPU's en nieuwe NVIDIA hardware.

Het wordt ook geprojecteerd om hoge nauwkeurigheid (HAC) modellen bij te houden op nieuwe PromethION 48 hardware. Adaptive sampling, dat al volledig beschikbaar is op GridION, is nu in beta-release op PromethION en MinION Mk1C en zal binnenkort volledig worden vrijgegeven. Hiermee kan 5-10X doelwitverrijking worden bereikt, afhankelijk van het doelwit De technologie van Oxford Nanopore sequentieert DNA- of RNA-moleculen van elke lengte, van kort tot ultralang.

Het is de enige technologie op de markt die in staat is DNA-lengtes van vijf orden van grootte in één enkele technologie te sequencen. Short Fragment Mode (SFM) is nu beschikbaar in de besturingssoftware van het toestel, MinKNOW, en is ontworpen om nanopore-sequencing van fragmenten van slechts 20 basen mogelijk te maken. Oxford Nanopore heeft meer dan 250M natieve menselijke reads, met een gemiddelde leeslengte ~ 200 bases, op een PromethION Flow Cell gedemonstreerd, waardoor veel potentiële toepassingen ontstaan waar kortere fragmenten moeten worden geanalyseerd, op schaal en tegen concurrerende kosten, maar met behoud van functies zoals real time methyleringsanalyse.

Na de analyse van het genoom van CTO Clive Brown zelf en van celvrij DNA geïsoleerd uit plasma - is de "cf Cliveome" dataset vrijgegeven. Hierbij wordt gebruik gemaakt van SFM, dat interessante biologie aan het licht heeft gebracht, waaronder de mogelijkheid van weefseltypering aan de hand van methyleringsgegevens en meer inzicht in nucleosoomregelingen. Er werd opgemerkt dat 28M CpG-methyleringsplaatsen op korte fragmenten in het menselijk genoom toegankelijk zijn voor nanopore-sequencing, vergeleken met 850K in de huidige arrays.

De O&O-teams van Oxford Nanopore hebben op MinION aangetoond dat het platform gebruikt kan worden om aminozuren in een korte peptidesequentie te karakteriseren. Dit is een eerste stap in de richting van de ontwikkeling van eiwitsequencing-mogelijkheden op het nanopore-platform en het verdere werk zal bestaan uit verdere optimalisering van de chemie om betere eiwitsignalen te bereiken en de ontwikkeling van analytische methoden om de kenmerken van onbekende peptiden te voorspellen.